-->
|
АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА SP4 С ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ СИНДРОМА WPW
В основе идиопатических нарушений ритма в значительной части случаев лежат врожденные структурные аномалии проводящих путей. Наиболее частыми причинами среди них являются аномальные дополнительные проводящие пути (ДПП), проникающие в сократительный миокард и механизм продольной диссоциации атриовентрикулярного соединения. Существует мнение, согласно которому, помимо чисто анатомических особенностей строения проводящей системы миокарда, в развитии нарушений ритма имеет значение и изменение ее функциональных свойств. В качестве одного из ключевых молекулярных субстратов межклеточного проведения импульсов рассматриваются белки коннексины, участвующие в формировании специализированных мембранных структур, обеспечивающих прямую связь между клетками. В клетках системы Гиса-Пуркинье человека наибольшую роль отводят коннексину-40, который обеспечивает высокую скорость проведения импульса к кардиомиоцитам [1]. В настоящее время имеются данные об ассоциации локального снижения экспрессии коннексина-40 в различных отделах предсердий с риском развития фибрилляции предсердий [3]. В экспериментах на модели «нокаутированных» мышей показано, что существенное снижение уровня коннексина-40 с нарушением его внутрисердечной локализации, обусловленное введением инактивирующей мутации в ген его транскрипционного фактора HF-1b, значительно увеличивает смертность животных, связанных с желудочковыми тахиаритмиями и атриовентрикулярными (АВ) блокадами при отсутствии морфологических изменений в сердце [2]. В связи с упомянутыми сведениями представляет значительный интерес исследование полиморфизма генов, кодирующих белки, определяющие структурное и функциональное состояние проводящей системы и изучение его связи с различными нарушениями ритма. Поэтому целью настоящей работы явилось изучение ассоциации полиморфизма гена SP4 человека, локализованного на 7-й хромосоме в районе p21-p13, являющегося гомологом гена транскрипционного фактора мышей НF1b, с электрофизиологическими показателями при синдроме WPW. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ В исследование был включен 81 пациент с синдромом WPW: 43 мужчины и 38 женщин. Возраст обследованных пациентов колебался в пределах от 7 до 62 лет, в среднем - 31,8±15,5 лет. Критериями включения в исследование было отсутствие у пациентов врожденных и приобретенных пороков сердца, перенесенных в прошлом миокардита и перикардита любой этиологии, острого инфаркта миокарда, острого коронарного синдрома и нарушений функции щитовидной железы. Давность «аритмического анамнеза» составила от 1 года до 46 лет, в среднем - 11,5±10,9 лет. Формы предвозбуждения желудочков были представлены манифестирующим синдромом WPW – у 41% больных, скрытым – у 37%, преходящим – у 17% и латентным – у 5% обследованных. У 86% (70 человек) обследованных регистрировали пароксизмальную реципрокную ортодромную атриовентрикулярную тахикардию, причем у 23% (16 человек) из них, в сочетании с пароксизмальной фибрилляцией предсердий. У 10% (8 человек) регистрировали пароксизмальную реципрокную антидромную тахикардию. У половины этих пациентов (4 человека) наблюдали пароксизмальную фибрилляцию предсердий. У 3 пациентов (4%) отметили изолированную пароксизмальную фибрилляцию предсердий. У всех пациентов регистрировали такие клинические особенности заболевания, как возраст манифестации тахикардии, частоту приступов тахикардии в месяц на протяжении последнего года, среднюю частоту сердечных сокращений (ЧСС) во время пароксизма тахикардии. Всем больным проводили чреспищеводное электрофизиологическое исследование (ЭФИ) с использованием комплекса «Элкарт» (ТОО «Электропульс», г. Томск) с оценкой состояния функции проведения АВ соединения и проведения через ДПП с определением их эффективных рефрактерных периодов (ЭРП). Эхокардиографические (ЭхоКГ) показатели получали с помощью эхокардиографа «UltraMark-9» (Канада). Оценивали ряд анатомических особенностей сердца (наличие пролапса митрального клапана, добавочных хорд), определяли размеры левого предсердия (ЛП), конечный диастолический (КДР) и систолический размеры (КСР) левого желудочка (ЛЖ), фракцию выброса (ФВ) и толщину задней стенки (ЗС) ЛЖ. Для всех пациентов рассчитывали индекс массы тела Кетле (ИМТ=масса тела (кг)/рост2 (м2)). В связи с тем, что на момент проведения исследования, данные по полиморфизму гена SP4 в мировой литературе отсутствовали, поиск информативных полиморфных маркеров в этом гене провели методом анализа мировых баз данных по однонуклеотидным полиморфным маркерам (ОНПМ) генома человека. В результате этого анализа для дальнейших исследований был выбран ОНПМ гена SP4 - NCBI SNP rs 1011168, локализующийся в пятом интроне, определяемый заменой А на Т в позиции 80807 и характеризующийся достаточно высокой частотой обоих аллелей в представленной в базе данных выборке хромосом. Для анализа полиморфизма этого ОНПМ была разработана методика генотипирования на основе аллель-специфической полимеразной цепной реакции. В реакции использовали следующие олигонуклеотидные праймеры: 1) 5’-aaatgaggacaatgaaaagcaca-3’-прямой (A) 2) 5’-gcctaagctgctactatttcagtg3’- обратный (A - com) 3) 5’-catttctcaattgcctgctataga-3’ –обратный (T) 4) 5’-actgttgccctttgttgcca-3’ –прямой (T - com). Праймеры 1 и 2 использовали для амплификации аллеля А80807 и праймеры 3 и 4 – аллеля Т80807. Оба аллеля амплифицировались одновременно в одной реакционной смеси. В случае гомозигот детектировался продукт размером 275 н.п. для аллельного варианта A и 171 н.п. - для T. Гетерозиготный генотип идентифицировали по одновременному наличию продуктов обоих размеров. ПЦР-продукт, получаемый с пары праймеров 2 и 4, имел размер 400 п.н. и детектировался при всех аллельных вариантах. ПЦР смесь объемом 12,5 мкл включала: 75 мM Трис-HCI (pH 9,0), 20 мM (NH4 )2 SO4, 0,01 % Тween-20, каждый из четырех указанных выше праймеров в концентрации 1,5 мкM, 0,2 мМ раствор каждого из четырех dNTP, 2,5 мM MgCI2, 2,5 единицы Тaq-полимеразы, 0,2-0,5мкг ДНК. Режим амплификации был следующим: начальная денатурация при 95оС в течение 5 мин., затем 30 циклов - с денатурацией в течение 45 сек при 95оС, отжиг в течение 45 сек при 67оС и синтез в течение 45 сек при 72оС. Детекцию ПЦР продукта проводили методом гель-электрофореза в 4% полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием. Сравнение средних значений электрофизиологических показателей в случае разных генотипов проводили после стандартизации по контролируемым независимым количественным и категориальным переменным с помощью процедуры «General Linear Model» пакета статистических программ SPSS. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В выборке обследованных пациентов с синдромом WPW вывялили 40 гомозигот по распространенному аллелю (А80807) (49,4 %), 34 гетерозигот (42%) и 7 гомозигот (8,6%) по более редкому аллелю (T80807). Частота более редкого аллеля (T80807) составила 29%. Для изучения связи полиморфизма гена SP4 с электрофизиологическими характеристиками синдрома WPW все обследованные пациенты были разделены на две группы в зависимости от генотипа по анализируемому ОНПМ. В первую были включены гомозиготы по более распространенному аллелю (40 человек), во вторую –. гетеро- и гомозиготные носители более редкого аллеля (41 человек). Сравнение средних значений показателей проводимости атриовентрикулярного соединения и дополнительных проводящих пучков, а также их эффективных рефрактерных периодов в этих двух группах проводили с помощью процедуры общего линейного анализа (GLM) на модели, включающей в качестве независимых факторов изученные клинические, эхокардиографические и электрофизиологические параметры, значимо влияющих на уровень анализируемого показателя. Перечень таких параметров для каждого показателя приведен в примечании к табл. 1. Стандартизованные средние значения анализируемых показателей в двух генотипических классах, приведены в табл. 1. Как следует из таблицы, обнаружены достоверные различия между группами пациентов с синдромом WPW, различающимися носительством аллеля Т80807, по средней скорости проведения импульсов по дополнительным путям (р<0,01) и среднему значению ЭРП ДПП (р<0,01). Таблица 1. Средние уровни электрофизиологических показателей в зависимости от генотипа по полиморфизму А80807Т гена SP4 у пациентов с синдромом WPW (M±m).
Где *- достоверная разница, p<0,05. В таблице приведены средние значения электрофизиологических показателей, стандартизованные по категориальным и непрерывным переменным, статистически значимо влияющим на значения анализируемых показателей в общей линейной модели (GLM): в случае АВ проводимости - пол, наличие пролапса створок митрального клапана, толщина задней стенки левого желудочка, частота приступов тахикардии в месяц и ЭРП АВ соединения. В случае ЭРП АВ соединения - толщина задней стенки левого желудочка и АВ проведение; в случае проведения по ДПП - наличие пароксизмальной фибрилляции предсердий, пролапса митрального клапана и добавочной хорды в левом желудочке, стадия гипертонической болезни, размеры ЛП, КСР, КДР, толщина МЖП, ЗС и ФВ, давность «аритмологического» анамнеза, частота приступов тахикардии в месяц, ЭРП ДПП. В случае ЭРП ДПП: КСР и ЧСС во время приступа тахикардии. Полученные данные позволяют предполагать, что полиморфизм гена SP4, ассоциирован с электрофизиологическими особенностями проводящей системы сердца у больных с синдромом WPW. Учитывая, что анализируемый ОНПМ расположен в некодирующей части гена, наблюдаемая ассоциация может являться как результатом собственного влияния данного полиморфизма на экспрессию гена, так и его сцеплением с влияющими на этот процесс аллелями других вариабельных участков гена. Наиболее вероятно, что модуляция экспрессии гена SP4 в свою очередь влияет на экспрессию гена, кодирующего коннексин-40, что далее определяет особенности ультраструктуры и функционального состояния проводящей системы сердца в зависимости от генотипа по анализируемому ОНПМ гена SP4. Таким образом, проведенное исследование свидетельствует о перспективности дальнейшего поиска генетических факторов, определяющих индивидуальные особенности аритмогенеза и в частности изучения его связи с полиморфизмом гена SP4. ЛИТЕРАТУРА 1. Coppen S., Dupont E., Rothery S, Severs N. Connexin 45 Expression Is Preferentially Associated With the Ventricular Conduction System in Mouse and Rat Heart // Circulation Research. - 1998. -Vol. 82. - P. 232-243. 2. Nguyen-Tran V.T.D., Kubalak S.W.; Minamisawa S.; Fiset S. A noval genetic pathway for sudden cardiac death nia defects in the transition between ventricular and conduction system cell lineages // Cell. -2000. - Vol. 102. - P. 671-682. 3. Van der Welden, H. M. W. et al. Gap junctional remodeling in relation to stabilization of atrial fibrillation in the goat // Cardiovasc. Res.-2000. - Vol. 46-P. 476–486. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Российский Научно-Практический |
Санкт-Петербургское общество кардиологов им Г. Ф. Ланга |